天然产物的分离方法一一结晶法
化学先生 / 2019-07-26
使天然产物结晶的最实用方法是让其从溶液中析出，结晶过程包括:①使含有一种或几种所需化合物的溶液达到过饱和;②形成晶核;晶体生长。结晶过程实质上是一个碰撞过程，分子相互碰撞形成簇晶，即晶核,然后此晶核逐渐生长为具有特征性内部结构和外部形状的结晶。搅拌和过饱和程度等因素都能对结晶过程产生影响。
将晶体溶于溶剂后，又重新从溶液中结晶的过程称为重结品。重结晶可使不纯的物质得到纯化，也可使混合组分彼此得到分离。选择重结晶溶剂的原则是使目标化合物具有适当的溶解度，过大和过小都不合适。化合物的溶解性随溶剂变化显著，混合溶剂的使用是将溶解度调节到所需水平的一种方便的方法。 在溶剂极性和重结晶温度的选择上有很大的灵活性。
如果样品化合物量充足，可取一些样 品溶解于结晶溶剂中制备饱和溶液,然后逐渐加人样品至不能再溶，也就是饱和点。必须注意样品的饱和度一般随温度升高而增大。 当只有少量的化合物样品时，可采用混合溶剂法。先将化合物溶于溶剂1，然后逐滴加人第二种可与之混溶的溶剂2.化合物在混合溶剂中的溶解性应比在单独的溶剂1中稍差。当溶液第一次变浑浊(即刚好过饱和)，加一滴溶剂 1使溶液澄清.此时接近于饱和点。过滤除去较大的污染物颗粒，再采用蒸发或冷却方法使溶液达到过饱和。蒸发操作通常在室温下进行，可将溶液敞开置于空气中或者在其表面覆盖打孔铝箔减慢其蒸发速度;也可以直接将氮气以缓慢流速引人溶液表面，加快挥发速度。
温度对结晶形态和纯度有着直接的影响。以酒石酸铁钠的外消旋体水溶液的结晶为例，当结晶温度在28C以下时，右旋和左旋体分别结晶析出,但当结晶温度高于28C时，形成外消旋混晶。而且，对映异构体单独结晶含4个结晶水，而外消旋化合物结晶含1个结晶水。1848年Louis Pasteur就是利用重结晶实现了酒石酸铵钠的手性分离，成为利用固态多晶型进行手性分离历史范例。需要提及的是这个范例肯定不是唯一的。事实上，多晶型现象广泛存在于有机化合物中，而且温度对从溶液中获得的有机化合物晶体的多晶形态的形成常有着重要的影响。
通常,有机小分子的溶解度随温度降低而下降。通过控制冷却的速度和程度，即控制过饱和程度，来控制成核速度和晶体生长速度。冷却速度可以用水浴来控制，而且可以简单地通过观察成核及生长情况来调节快慢。若形成微品,则表示冷却速度过快，过多晶核的迅速形成，将最终导致生成大量微小的晶体。因此，减缓结晶生长，防止形成多余的晶核有利于形成较大的晶体，尤其是在单品培养中更应该严格控制晶核的数量。
减缓溶剂蒸发和冷却的其他重要方法包括:蒸气扩散法溶剂界面扩散法和热梯度法等。蒸气扩散法利用了一种独特的溶剂混合系统，达到了比滴加溶剂更慢的溶剂混合效果。一般操作过程为:①将样品置于.个小试管中,加人足够 量的溶剂1制成近饱 和溶液;②将试管置于-个较大的烧杯中，在烧杯中加人适量的可与溶剂1混溶的溶剂2后,将其密封;溶剂2应有足够的挥发性扩散人溶剂1中,形成一个混合溶剂体系，化合物在此混合溶剂中的溶解性比单用溶剂1要差;③蒸发溶剂1将有助于过饱和溶液的形成。虽然蒸气扩散过程事实上增加了重结晶溶液的体积,但由于其避免了形成大量晶核而具有应用优势。理想的溶剂2应该具有更好的挥发性,并且与溶剂1相比对重结晶化合物的溶解性稍差。溶液界面扩散法与蒸气扩散法类似，能实现比滴加溶剂更慢的溶剂混合效果。首先将小体积的溶剂1加人一细玻璃 毛细管中，如用于测定熔点NMR分析或X射线粉末衍射的细玻璃管中;然后使用一支注射器,将密度较小的溶剂2小心滴加于溶剂1的表面,样品可溶于两者间任意一种溶剂中。 假如界面溶剂混合程度诱导了过饱和，将观察到在界面上晶体的生长。热梯度法是将固体与溶解性相对较差的溶剂接触，加热溶解后经对流/扩散,溶剂携带溶质进人较冷区域时产生结晶。高质量的X射线衍射结构测定用单晶的培养必须限制在有限数量的品核内，经过几天非震动环境下速度缓慢的生长才能完成。
结晶作为一种分离方法,其原理 相当简单。例如，假设我们得到的产物包括目标化合物A和混有的杂质B和C.则可进行如下结晶分离①选择溶剂使B和C在任意温度都可溶，而组分A不是，将混合样品溶解于热溶剂中;②冷却溶液析出一部分 A,与组分B和C分离:③重复步骤①和②的操作,每次使用新溶剂，直至达到分离的纯度要求(通常从混合物中经一步结晶不能保证结晶产物的化学纯度)。这个方法的缺点是损失可能较大，而且对于少于100 mg的样品，色谱技术可能是更为合适的分离方法。对于上述分步结晶方法,需要考虑目标化合物的回收率时可以按下列操作步骤进行:①将目标化合物结晶并保留滤液;②将结晶溶解于新溶剂中:③重结晶产物并保留滤液;④浓缩步骤①中产生的滤液，得到的结晶溶于步骤③的滤液中重结晶。这个简单的顺序充分利用了两次的滤液来获得二次结晶产品。当然,可以将目标化合物结晶，杂质留在溶液中，例如，将20 ml红辣椒或辣椒粉的乙醚提取物浓缩液用60 ml.石油醚稀释后,冰箱中放置24 h,则析出几乎纯的辣椒红素晶体。也可以将杂质结晶，目标化合物留在溶液中;例如，在生产药用鱼肝油时，饱和酰基甘油如硬脂酸甘油酯可以通过冷却以沉淀的形式从粗鱼肝油中滤除，不饱和酰基甘油留在溶液中。
过饱和溶液常放置很长段时间 而不产生结晶。如果不是纯度问题，可以尝试下列操作:①虽然过度的搅动可产生相反的影响，但搅拌可以通过增加溶液的碰撞频率而增强成核作用;②结晶可能在外来物表面生长,可以将三角瓶敞口置于有灰尘空气中，这是刺激结晶所需要的，如果有晶种就更为有利;③将热溶液过滤进一-冷 的三角瓶中,以达到快速冷却的目的，这经常足以诱导快速结晶，而且用刮具使玻璃三角瓶内璧粗糙同样会有帮助;④温度交替变化可能是有利的。过饱和溶液冷却至冰箱的冷藏或冷冻室温度，以降低溶解度，并且希望诱导成核，然后升至室温，促进晶核生长为结晶。这样做防止了因过分冷却而增加溶液黏度，从而导致阻碍结晶进程的可能性。
如果只有少量的化合物用来结晶，则可考虑蒸气扩散技术,这种技术适合于毫克量级物质的结晶。特别是在此基础上发展出的悬滴法，被证明对于结晶毫克量级的蛋白质是一种非常受欢迎且有效的方法。从原理上看，悬滴法不仅限于大分子，而且也是前面所描述分离方案的简单改造，值得用少量的天然产物来尝试。将化合物溶于1滴溶剂1中,并且此液滴悬浮于盖在盛有溶剂2的容器上方的玻璃盖玻片上,蜡封体系避免溶剂挥发。蒸气扩散造成了过饱和并且希望结晶生长。可以观察到生长于悬滴中的结晶并且方便的回收,这种方法已经被用于在体积低至5~15 pL的液滴中生长蛋白质晶体，悬于500 μL体积的容器上。当只有少量化合物时(约5 mg),液体扩散和热梯度方法同样是有用的。
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