洗脱
抖化学 / 2022-11-17
一旦吸附剂制成之后，可以用两种方式使之作为分离系统使用。对于更成熟的色谱法，则需用常规的柱方法。然而分批分离则简单地包括将混合物与吸附剂淤浆共同保温，在烧结板上过滤以除去吸附剂，这常常是合适的，这样就免去了耗费时间的柱的填充和平衡。
如果选用柱系统，洗脱就可用很多方法来完成。通常可以找到一种物理参数如pH或离子强度的适当的大幅度变化，或者是分段的或者是梯度的。曾用脲或盐酸胍这类变性剂来洗脱被强烈吸附的、可再生的蛋白质。有时，特别是当涉及到免疫吸附剂时，其亲和性极大以致根本不能使用常规洗脱法。在这些情况下，人们可借助于使用可降解的间隔基“手臂”。偶氨桥键很有用，因为它们可以在连二亚硫酸盐还原作用的温和条件下断裂。为了促进从抗球蛋白免疫吸附剂上回收淋巴球细胞，可使用明胶间隔基，在B淋巴球的生物吸附之后，该间隔间即可用骨胶原酶消化掉，从而释出具有充分细胞活性的免疫球蛋白群。最高超的洗脱法还在于进一步利用生物特异性。洗脱剂中含有过量的配位体，它就与固定的配位体竞争吸附的分子。这种类型洗脱的功效强烈提示，生物亲和色谱法比非特异的效应优越。下面讨论的包含一般配位体的此技术的一个方面，生物洗脱起重要的作用。
等度洗脱
等度洗脱又称无梯度洗脱，恒溶剂洗脱。在色谱洗脱过程中，是流动相的组成保持不变的洗脱方法。
高效液相色谱仪是一个强有力的分离分析工具，但是作为洗脱用的流动相并不单纯是一种溶剂，而由两种或两种以上的溶剂(或缓冲液)以不同百分比组合而成。例如：甲醇-水、乙腈-磷酸缓冲液和己烷-乙酸乙酯等，以不同百分比组成流动相。如果洗脱过程中溶剂的混合组成不变，就称作等强度洗脱，即溶剂强度保持不变。如果洗脱过程中溶剂的混合组成随时间变化，称作梯度洗脱。依照溶剂强度随时间变化的梯度洗脱技术在液相色谱中是十分有用的，不少难分离的物质对以及极性相差较大的混合物需要依据梯度洗脱得到分离：
梯度洗脱
对于组分复杂的样品，采用单一的流动相系统很难得到理想的分离结果。要么分离时间太长，要么分离度太差。梯度洗脱是指在分离过程中逐渐改变溶剂的组成，使溶剂强度从分离开始到结束逐渐增加的洗脱方式。即随着时间改变，连续改变流动相的极性，使复杂组分得到良好的分离。
梯度洗脱方式有两类
1.外梯度洗脱外梯度洗脱又称低压梯度洗脱，即将溶剂在常压下，通过程序控制器使溶剂按一定比例混合后再由高压泵输入到色谱柱。
2. 内梯度洗脱内梯度洗脱又称高压梯度淋洗，是将溶剂经高压泵加压后再混合的洗脱方式。
梯度洗脱的特点
柱效提高；
2. 检测器的灵敏度得到改善；
3. 当复杂样品中不同性质成分的保留因子(k')相差很大(几十倍至几百倍)时，使用梯度洗脱可以得到更好的分离效果。
梯度范围是指流动相中强溶剂分别在起始液和终止液中的浓度。调节梯度范围对得到最佳的梯度分离起重要作用。
注意事项
在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不断变化，因此必然带来一些特殊的问题，必须充分的重视。
1. 要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相有些溶剂在一定的比例内互溶，超出一定的范围后就不会互溶。例如：乙腈和1mol/L的醋酸铵(pH5.16)做梯度洗脱，乙腈含量超过70%时就会出现不溶；当有机溶剂和缓冲溶液混合时还可能析出盐的结晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心。
2. 梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高，以保证好的重现性进行样品分析前必须进行空白梯度洗脱，以辨认溶剂杂质峰，因为弱溶剂中的杂质富集在色谱柱头上后会被强的溶剂洗脱出来
3. 混合溶剂的黏度常随组成而变化，因此在梯度洗脱时常会出现压力变化例如纯水或甲醇的黏度都比较小，但是当二者以相近的比例混合时黏度会增大很多。因此要防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱所能承受的最大压力。
4. 每一梯度洗脱程序完成后，必须对色谱柱进行重新平衡，使其恢复到初始的状态一般需要10～30倍柱容积的初始流动相，使固定相和初始流动相达到完全平衡。
5. 注意梯度洗脱用水的有机物残留往往在等度洗脱时用的水，在梯度洗脱时出现未知峰(“鬼峰”)。这是因为在梯度过程中，水的比例很高时流动相洗脱能力很低，此时水中的有机物残留就被色谱柱吸附并浓缩，当强溶剂占高比例时，浓缩的有机物被高洗脱能力的流动相洗脱而流出色谱柱，并成为一个色谱峰，从而干扰分析。
梯度洗脱程序及其模式
1.线性梯度
在梯度洗脱时，流动相强度的变化与梯度时间成线性比例。在一定时间内流动相强度增加越大，直线斜率越大。
2.指数梯度
在梯度洗脱时，流动相强度随梯度时间变化称指数关系。
凹形：梯度起始阶段强度变化缓慢，随时间增加，强度变化加快。
凸形：起始阶段梯度速度变化快，终止阶段梯度速度变化慢。
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