马肝脱氢酶的纯化
抖化学 / 2022-11-17
马肝脱氢酶的纯化目的 为说明亲和色谱 法可以有效地用于复杂分子的特异分离。
设备 实验室常规设备，必须洗涤清洁。凝胶电泳设备。本实验的设备由Pharmacia(G.B)有限公司提供(包括Pha-rmacia的电泳仪GE-4的说明)。
材料 样品:S'-AMP-Sepharose 4B 0.5克;马肝提取液3毫升;蔗糖;商品ADH0.1毫升(含量5毫克/毫升)。缓冲液: (1)0.1M, pH7 .5磷酸钠缓冲液+1mM谷胱甘肽100毫升; (2)0.1M, pH7 .5磷酸钠缓冲液+ 1mM谷胱甘肽+0.05mMNAD*50毫升;(3)0.1M, pH7 .5磷酸钠缓冲液+1m M谷胱甘肽+0.05m MNAD+ +1.1 m M吡唑20毫升。P .A.A梯度凝胶; 1%酰胺黑，溶于50毫升7%醋酸中; 0.1M甘氨酸pH10 2.5升; 7%醋酸( V/V ) 1升。
操作步骤 1.凝胶的制备。在盛有0.5克冷冻于燥的5'-AMP Sepharose 4B的瓶中充满缓冲液(1);转动5分钟。向根短柱(100×0.5毫米)中加一些缓冲液(1) (约至10毫米深)，堵住出口。向柱中倒入上述凝胶悬浮液，使其沉降。插入联接的塞子直到刚好在凝胶的表面之上。打开出口用50毫升缓冲液(1)以最高流速冲洗(使凝胶在环境压力流下填充得紧密)，然后，使柱头接头落到凝胶表面的顶端。弃去流出液。
2.加入马肝粗提取液。用巴斯德移液管吸取2毫升马肝粗提取液加到柱的顶部，用100毫升量 简收集流出液。当样品通过柱子时，使流速减至最低(使之有一定的反应时间，以使脱氢酶与基质结合)。用缓冲液(1)冲洗。
3.非特异性吸附蛋白质的洗脱。当收集的洗脱液总量达5毫升时，使流速增至最大值(将色谱柱下端的活塞完全打开)，用40毫升缓冲液(1)冲洗。在这阶段开始准备电泳仪(见第6条)。转变至缓冲液(2)，以最大流速冲洗40毫升。
4.ADH的特异顶替。转到最低流速;用缓冲液(3)洗脱ADH,用10毫 升的量简收集流出液。弃去最初的4毫升，收集3毫升纯的ADH。立即开始进行浓缩。
5.洗脱的ADH的浓缩。用塑料注射器将洗脱液转移到Mini-con浓缩器中，浓缩10倍。浓缩液转移入小管。
6.用聚丙烯酰胺凝胶梯度电泳法，鉴定 制备的ADH及测定共纯度。电泳设备按照标准方法组装(见Pharmacia仪器手册GE-4,第4页，步骤3-22,或其它设备的适宜的组装步骤)。
向三个样品管分别加入马肝粗提取液，制备的浓缩ADH溶液和市售的ADH(用作比较)。加入蔗糖以使样品液的比重大于电泳缓冲液。
加样及电泳试验(详见Pharmacia GE-4说明第6页，或其它电泳仪说明的适当部分)。用Hamilton微量注射器将各10微升上述三种样品加至电泳仪的放样品部位。进行电泳。
试验完毕，取出凝胶在培养皿( Petri dish )中染色(详见Pharmacia GE4说明第6页，或其它适当资料)。
结果 马肝醇脱 氢酶的亲和色谱法纯化结果示于图1355。图中上面部分描记的是粗提取液，中部是本实验制备的纯ADH,下部是市售的ADH。
结论 虽然这一实验 所涉及的工作相当复杂，但实际并非如此。结果表明(图13- 55)本技术能够从复杂的生物混合物中制备出纯样品，比市售的纯度更高。
但须指出，亲和色谱法的最后成功，将取决于实验人员的技能，即是否把适当的配位体结合于适当的基体上，以使活性部位可与所需纯化的组分发生相互作用。
.jpg "实验图")
闽ICP备15011996号-4
|
闽公网安备32011202000099号
|
