凝胶色谱法的实验选择方法及其应用
实验室k / 2019-07-27
实验条件的选择与实验方法
1.凝胶的选择 根据上述凝胶色谱的原理，分离方式大体上可分成两种类型。
一类是从低分子量物质中除去高分子量物质，或者从高分子量物质中除去低分子物质。这种被分离物质之间的分配系数有着明显的差别，称为组别分离。可使用各种型号的葡聚糖凝胶，以选G-25或G-50为好。一般，从低分子量物质中除去高分子量物质选用交联度小、孔隙较大的型号；反之，选用交联度较大、孔隙小的型号为好。
另一类是被分离物质的分子量比较接近，分配系数介于0～1之间。这种分级分离比组别分离要求高，常用于分子量的测定。一般采用交联度小、吸水量大的凝胶，如G-75、G-100、G-200。
2.凝胶的浸泡溶胀 将所需的干凝胶浸入相当于其吸水量10倍的洗脱剂中。例如1gG-50，加50ml(10×5ml)洗脱剂，缓缓搅拌使其分散在溶液中，防止结块，但不能用机械搅拌器，避免颗粒破碎。浸泡时间根据交联度而异，交联度小的吸水量大，则需时间较长，也可加热膨胀。所制备的凝胶匀浆不宜过稀，否则装柱时易造成大颗粒下沉，小颗粒上浮，致使填充不均匀。
3.色谱柱的制备 在凝胶色谱中，影响分离度的柱变量中最重要的是柱长度、颗粒直径及填充的均匀性。虽然理论上认为用足够长的柱可以获得不同程度的分离度，分离度随柱长的平方根而增加，柱长加倍，分离度增加40％，但流速至少降低50％。在凝胶色谱中原来就存在着分离速度较慢的缺点，因此，凝胶色谱是很少应用长于100cm的柱。当分离K值较接近的组分时，柱长需超过1m，则可采用几根短柱串联。
颗粒直径对分离度作用是显著的，应用小顺粒可以改进分离度。
装柱的方法和一般柱色谱相似，填充时不应有气泡，填充后用同一种洗脱剂以2～3倍总体积稳定柱长。填充均匀与否则可用0.2％蓝色葡聚糖(分子量2000，溶于同一种洗脱剂中)溶液通过柱床，观察其在柱内移动情况来判断填充的均匀程度。
4.样品的制备 在凝胶色谱中，由于分离对象是大分子量的物质，当样品浓度大时，粘度也随之增大。因此，样品的浓度应视其粘度而定。如果样品粘度相对于洗脱剂粘度的3～5倍时，则要损失分离度。
凝胶色谱的上样量可比其他的色谱形式大些，如果是组别分离，上样量可以是柱体积的25～30％；如果分离K值相近的物质，上样量为柱体积的2～5％。
5.洗脱 在凝胶色谱中，洗脱用的溶剂应与浸泡膨胀凝胶所用的溶剂相同。如果换溶剂，凝胶的体积会发生变化从而影响分离效果。除非含有较强吸附的溶质，一般洗脱剂的用量也只需一个柱体积就够了。洗脱用的溶剂可以是水、不同离子强度的溶液或不同pH值的缓冲液。对吸附较强的组分也有使用水与有机溶剂的混合液的，如水-甲醇、水-乙醇、水丙酮等，以降低吸附，将组分洗下。
洗出液多采用分段收集法，然后用适当的方法分析组分流出和分离情况。
应用
凝胶色谱技术得到了广泛的应用。特别是在生物化学方面解决了用一般方法不易分离的许多问题。近年来开始用于较小分子物质的分离，也取得了成功。
1.脱盐 在分离生化样品时，常常需要加入不同pH缓冲溶液，或者采用盐析法，使样品带入各种电解质，如蛋白质溶液的脱盐等，常常采用交联度较大的凝胶，例G-25或Bio-P-2，即使样品体积是柱体积的25～30％，也不损失分离度，分析速度快且蛋白质和酶不变性。
为防止脱盐过程中由于电解质的减少引起蛋白质沉淀在柱上，使分离失效，则可在操作时先用挥发性盐类的缓冲溶液平衡柱床，然后再加入样品分离。
2.浓缩 利用干凝胶吸水膨胀的性质(如G-200可吸收它本身重量20倍的水分)，将它加进高分子溶液中，在凝胶膨胀时，水和低分子物质进入颗粒内部的孔隙，高分子物质被排阻在颗粒外部溶液中，从而达到分离目的。例如自海水中浓缩少量的维生素B12、分离一些受热易变性的蛋白质等。
3.去热源 去离子水只是除去了离子，还没有除去热原。热原系多糖和蛋白质的复合物，分子量约90000。常用DEAE-A-25(二乙氨乙基-阴-25)凝胶柱来进行分离，它既具有交换阴离子的能力，又有一定的网孔作用，可以除去分子量小于100000的物质。该法用来除去大型输液、注射用水或核苷酸注射液中的热原。
4.测定分子量 凝胶色谱法常用来测定大分子物质(如蛋白质)的分子量，特别是球蛋白的分子量。它们的洗脱特性与组分分子量有关，即有一定的线性关系，可用下式表示:：
VR＝K1-K2logM
式中：K1和K2为常数，M为分子量
测定时，先用同类型不同分子量的化合物，在适当的凝胶上，找出洗脱体积和分子量之间的关系，绘出校正曲线，由此曲线上再求出未知样品的分子量。
5.测定聚合物分子量的分布情况 高分子物质的分子量分布比它的平均分子量更有意义，但平均分子量容易测定，而分子量分布的测定比较困难。凝胶色谱法较简便地解决了这个问题，其原理与方法和测定分子量相同。根据样品的洗脱曲线分段收集流出液，可以看出一个聚合物中分子量的分布情况。此法已广泛地用来测定右旋糖酐、聚乙烯等聚合物的分子量分布。
可以相信，随着凝胶新类型的研究改进，在加压情况进行工作，并与适当的检测器和记录器联用，不仅可大大加快分离速度，而且可提高分离效率。
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