高效液相色谱的热力学基础
实验室k / 2019-08-01
在近代色谱技术中，高效液相色谱(high performance LC，HPLC)是最受重视的分析技术之一。液相色谱虽然是一种有效的分离方法，但还存在柱效低和分析时间长等缺点。早在1941年， Martin曾指出，如减小填料的颗粒直径，增加柱长和柱压有可能克服这些缺点。1967年Horvath C试制了在70μm玻璃珠上覆盖离子交换树脂的薄壳型填料，应用高压输液泵进行洗脱，并配备紫外检测器等组成了自动输液、检测的液相色谱仪。此后各种新型薄壳型填料和化学键合相填料陆续问世，使液相色谱的应用更为广泛。
高效液相色谱的特点是高速化和高效化。
高速化，在过去需要几小时或几天才能完成的分离工作，现在仅需几分钟或几十分钟即可完成。因而还可称为高速液相色谱(high speed LC，HSLC)。但也有人认为高压才是本法与一般液相的基本区别点，因而称其为高压液相色谱(high pressure LC，HPLC)。
高效化，微粒型填料(5～10μm)高压匀浆装柱技术的应用，使全多孔微粒型填料进入实用阶段，将柱效提高到每米几万，甚至十万以上的理论板数。同时，各种高灵敏度检测器的出现(如荧光、电化学)，使检测灵敏度达到10(-12次方)～10(-14次方)g水平，为高效化提供了条件。
从当前的发展情况看，HPLC虽在单位长度(每米)内有很高的板数，但限于柱压，实际应用的柱长都在25cm左右，总柱效约在一万理论板数。近几年来出现了微型填充柱(内径1mm)和毛细管液相色谱柱(内径0.05mm)，其实际总柱效可达十万理论板数。此外，HPLC与质谱计、核磁共振仪、红外光谱仪联用，以及计算机数据处理和操作程序控制的全自动化等已有了很大的进展，与气相色谱相比，它的适应范围更广，难气化的、热不稳定的样品都可应用。在进样量方面，一次进样可达100g，适宜作大量制备。因此，它在色谱分析中占有极重要的地位。
高效液相色谱与一般液相色谱相似，包括液-固色谱(HPLSC)、凝胶色谱(HPGPC)、离子交换色谱(HPIEC)和液-液色谱( HPLLC)，其中HPLLC还可分为经典固定相和化学键固定相。
高效液相色谱的原理与一般液相色谱十分相似，样品的分离取决于其在流动相和固定相中的分配。从色谱理论可知，一种物质的保留和分配是由热力学和动力学两组参数所决定的，这两组参数几乎彼此无关，但可以选择最佳条件以获得最佳分离。
在液相色谱中所涉及的一系列热力学参数，例如分配系数(K)、容量因子(K')、保留体积(VR)、调整保留体积(V'R)、比保留体积(Vg)、相比率β(Vs/Vm)、相对保留值(α)等在高效液相色谱中具有相同的含义，与此相关的一些方程也都适用。
在LLC中，如在压力P、温度T的平衡条件下，溶质在两相中的化学位μ相等：
μs(T，P)=μm(T，P)
式中：s和m分别表示固定相和流动相，则比保留体积为：
式中：γm，∞和γs，∞是溶质在无限稀释时的活度系数，Mm和Ms是相的分子量，ρm(T)是温度T时流动相的密度，P拔是平均柱压，Vm和Vs是溶质在两相中的克分子体积。该方程可通过活度系数来预测分配性质。保留时间和K之间存在线性关系：
tR=t0(1+βK)
在混合物中如有两种组分(1和2)，其相对保留值为：
此值仅仅决定于组分在两相中的性质上差异。也就是说，相对保留值是量度组分分配的热力学性质上的差异，或者是量度两种组分分配的自由能的差异。因此，在LLC系统中，可以通过改变流动相或固定相来改进分离。
为此，梯度洗脱的应用已成为液相色谱的常用洗脱技术，在各类高效液相色谱仪中都备有梯度洗脱装置。从LLC的热力学基础来看，显然可通过调节相对保留值(α)及分配比率(K')来改进两个相邻区带的分离度。在HPLC的分离中，不能忽视分配比率-容量因子的作用，为了达到理想的分离度，需找出一个最佳的容量因子，但是，用单一溶剂时，样品的各组分K'值决不会是最佳的。在热力学上，容量因子决定于溶剂强度，因此，用梯度洗脱，可使各组分有一个合适的K'值，使分离改善。
在LSC系统中，各组分的分配系数主要决定于其与溶剂、吸附剂之间的色散力(非极性)和氢键力(极性)的总和。由于溶剂分子和样品分子在吸附剂表面的活性位置上有一竞争作用，如吸附样品分子，则必须先解吸溶剂分子。因此，除考虑吸附剂的化学性质外，还要考虑相互之间的竞争作用。样品分子在非特殊性吸附剂上的保留体积与其功能团的性质无关；而在特殊性吸附剂上分离时，由于溶剂与吸附剂之间无特殊作用，使含有极性基团或π键的样品分子其保留体积有了显著增加。
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