单分子光谱
化学先生 / 2019-09-02
早在量子力学建立的初期，著名的诺贝尔奖获得者Feyneman就梦想着能在原子、分子尺度上观察和操纵物质世界，然面多年以来，人们对微观世界的观测和研究都是建立在系统平均(system average)的基础上。直到20世纪80年代扫描隧道显微镜、荧光探针、光镊技术等的出现，进人20世纪90年代单分子科学的形成与发展才使人们真正实现了Feyneman的梦想。
顾名思义， 单分子光谱就是单个分子的光谱，实际上通常是对单个生 物分子动态行为的光谱分析。那么为什么要进行生物单分子光谱的研究呢?因为在普通的光谱技术中，实验中探测到的是大量分子的综合平均效应，得到的是系统的平均响应和平均值，这一平均效应掩盖了许多特殊的信息。而单分子光谱研究可以排除系统的平均效应，有利于复杂环境中同种分子不同行为的分析，通过对体系中的单个分子进行研究，从而得到单分子体系的动力学过程。例如，可以实时了解生物大分子构象变化的信息:可以观察微环境对单分子体系的影响，从面得到与分子微环境相关的信息。目前主要的技术手段包括生物大分子荧光光谱，单分子荧光能量转移谱，与原子力显微镜结合进行单分子水平的分子间相互作用力的测量，以及可进行单分子操作的激光光钳，高时间分辨率的单分子轨迹追踪等。
荧光单分子检测技术是用荧光标记来显示和追踪单个分子的方法。1976 年，Hirschfeld检测到标有80~100个发光团的单个抗体分子，开创了单分子检测的先河。1994 年Moerner首先在水容器风干表面对单荧光团进行显像观测，1995 年Funatsu 等又利用全内反射显微镜(total internal reflection microscopy, TIRFM) 在水溶液中观察到单个荧光基团标记的蛋白质分子，井追踪其运动轨迹，真正实现了SMS对单荧光分子的检测。由于荧光信号测量灵敏度高以及光子对分子干扰最轻微，SMS被广泛应用于单分子研究。尤其对于需观察细胞内单分子实时变化的细胞生物学研究，SMS可能是唯-有效的技术。
单分子荧光探测必须满足两个基本要求:一是在被照射的体积中只有一个分子与激光发生相互作用;二是要确保单分子信号大于背景的干扰信号。背景信号来自于Raman散射、Rayligh散射、溶剂中杂质、盖玻片的背景荧光和探测器的暗电流。因此，行单分子探测要求:①激发容积要小，因为背景的吸收与激发体积成正比，尽量减小激发体积可降低背景干扰;②高效的收集光学系统;③灵敏的探测器;④采用针孔装置，或将溶剂中杂质预漂白以及用低荧光光学材料等方法清除背景荧光。
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