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色谱分离的原理及应用


化学试剂,九料化工商城 / 2020-11-26

 色谱分离的原理及应用

   色谱分离( chromatography),过去亦称色层分离,色是分析,很不统一、现在根据1975年科学出版社出版,“英汉化学
化工词汇补编(分析化学部分)》所定的译名,本节都用色分离这个名词。
   色谱分离是一种分离和鉴定化合物的有效方法.开始仅用于分离有色化合物,现已广泛应用于无色化合物的分离和整定,按它的分离原理来说,大致可分为吸附色分高和分配色谱分离两种。
色谱分离
   吸附色谱分离主要是以氧化铝、硅胶等为吸附剂,将一些物质自溶液中吸附到它的表面上,而后用溶液洗脱或展开.利用不同化合物受到吸附剂的不同吸附作用,和它们在溶剂中的不同溶解度,亦就是利用不同化合物在吸附剂和溶液之间分布情况不同而得到分离例如有甲和乙两种化合物混在一起,当它们的溶液通过氧化铝柱时,甲和乙都被吸附,溶剂向下流,这是第一步产生的现象吸附后,用极性稍大的溶剂冲洗氧化铝柱时,溶剂即替代甲和乙的位置,被氧化铝吸附甲和乙被溶剂溶解(亦即解吸)随着溶剂自上而下移动、在移动过程中,甲和乙遇到新的氧化铝时,又被吸附,溶剂继续向下流如此反复进行,也就是甲和乙被氧化铝吸附,被溶剂解,再吸附,再溶解……因此自上而下慢慢移动甲的亲水性稍大,被氧化铝吸附较强,在溶剂中溶解度较小,也就移动得慢一些乙的亲脂性稍大一些,较难被氧化铝吸附,在溶剂中溶解度稍大,也就移动得快一些,随着溶剂的冲洗,二者分离,最后达到完全分离的地步如果继续用溶剂冲洗,乙必定先被洗出来,而后甲被洗出来.多种化合物混在一起,它们的分离原理也是一样,只是更复杂一些.吸附色谱分离可采用柱色谱和薄层色谱两种方式。
  分配色谱分离主要是利用混合物的组分在二种不相混溶的液体中分布情况不同而得到分离相当于一种连续性溶剂抽提方法.这样的分离不经过吸附程序,仅由溶剂的抽提而完成固定在柱内的液体名为固定相,用做冲洗的液体叫做移动相.为了使固定相固定在柱内,需要一种固体如纤维素等来吸住它,称为“载体”.载体本身没有吸附能力,对分离不起什么作用,只是用来使固定相停留在柱内.进行分离时,也是先将含有固定相的载体装在柱内,加入样品溶液后,用适当的溶剂进行洗脱.在洗脱过程中,移动相和固定相发生接触.由于样品组份在二相之间的分配不同,因此被移动相带着向下移动的速度也不同.易溶于移动相中的组份移动快一些,而在固定相中溶解度大的组分就移动慢一些,因此得到分离.分配色谱分离也可采用柱色谱和薄层色谱两种方式.纸色谱也属于分配色谱分离。
色谱分离在有机化学上的应用
(一)分离混合物:一些结构类似,理化性质相似的化合物混在一起,往往不是应用一般化学方法所能分离的,但应用色谱分离,有时可以达到有效分离的目的。
(二)精制提纯化合物:有机化合物中含有少量结构类似的杂质,不易除去,也可利用色谱分离除去杂质,得到纯品。
(三)鉴定化合物在一定的条件下,纯粹的化合物在薄层色谱或纸色谱中都显呈一定的移动距离,称比移值或值(见144页).所以利用色谱分离可以鉴定化合物的纯度或确定两种性质相似的化合物是否为同一化合物。
(四)观察一些化学反应是否完成:在某些反应中,可以利用薄层色谱或纸色谱观察原料色点的逐步消失,以证明反应的完成。
  现在常用的色谱分离方法有柱色谱、薄层色谱和纸色谱等柱色谱主要用以分离混合物和精制化合物,薄层色谱和纸色谱主要用以分离和鉴定化合物,三者常需相辅进行.利用薄层色谱和纸色谱可以摸索柱色谱的分离条件.在柱色谱中也要利用薄层色谱和纸色谱以鉴定、分析和分段收集冲洗出来的溶液中的成分。
柱色谱
  柱色谱(即柱层离、柱层析)包括以氧化铝、硅胶等为吸附剂的吸附色谱分离和以纤维素等为载体的分配色谱分离.现在主要介绍以氧化铝为吸附剂的柱色谙的操作方法。
(一)吸附剂:一般以氧化铝为主.商品中有专供色谱用的活性氧化铝.柱色谱用的氧化铝以通过100-150目孔的粉末为.粉末太粗,溶液流出太快,分离效果不好;粉末太细,流出太慢,色谱用的氧化铝通常可分碱性、中性及酸性三种。
   碱性氧化铝适用于碳氢化合物,生物碱以及其他中性化合物的分离.它的水提取液的pH值一般为9-10.氧化铝水提取液p的测定,可取1克氧化铝,加30毫升蒸水意沸10分钟,冷却,滤去氧化铝后,测定滤液的pH值中性氧化铝应用最广,适用于醛、、以及酯等化合物的分离,它的水提取液的pH值为7、可取色用性化铝,加2倍量的5%醋酸溶液煮沸10-20分钟不时加以搅拌.放置后,倾去上层清液,再用水洗涤5、6次、最后在布氏漏斗上用水洗涤数次,尽量去除残留的醋酸,抽、干燥、最后在高温炉中活化。
  酸性氧化铝适用于有机酸类的分离,它的水提取液的pH值为4-4.5.可取氧化铝,加入2N盐酸溶液,使混合物呈刚果红酸性反应倾去上层清液,用热水洗至刚果红试纸呈弱紫色,滤集后,干燥,加热活化即成。
  氧化铝的活性分I-V五级一般用II一III级偶亦有用IV级的,I级的吸附作用太强,V级的吸附作用太弱,都不适用、关于活性的测定,现多用海氏( Hehmanek)法,在薄层板上进行活性测定.方法简便,详见薄层色谱项下。
  吸附剂的活性和它的含水量有关.如将氧化铝放在高温炉(350-400℃)烘烤3小时,得无水物加入不同量的水分,即得不同程度活性的氧化铝(见表2.6.1).例如欲制取III级氧化铝,可在无水氧化铝中加入6%水即成.为了使氧化中水分均匀,可先称取无水氧化铝940克,放在紧塞的圆底烧瓶中.另在一烧杯中,加入50毫升蒸馏水(略少于计算量),逐渐加入烧瓶中的氧化铝,搅拌均匀使不再有粘结现象,然后将此烧杯中的氧化铝倾入圆底烧瓶中,振摇8小时,测定活性,得约级活性氧化铝。
表2.6.1吸附剂的活性和含水量的关系
活性                            I    II    III    IV    V
氧化铝加水量,%      0   3     6    10   15
硅胶加水量,%          0   5    15    25   38
硅胶可同上法处理
(二)装柱:装置如图2.6.1,玻璃管的大小和粗细,依要分离样品的用量而定,一般来说,管的高度约为直径的20一30倍.
  先用洗液洗净玻璃管,用水清洗后,用馏水清洗,干燥,在玻璃管底一层玻璃丝或脱脂棉,而后将氧化铝装入管装入的方法分湿法和干法两种.湿法是将备用的溶剂入内、而后将氧化铝和溶剂调成浆状,慢慢地倒入管中,应将管的下端活塞打开,使溶剂慢慢流出,吸附剂即渐渐沉干管底加完氧化铝后,继续使溶液流出,直至氧化铝的沉降不再变动。
   干法是在管上端放一漏斗,使氧化铝均匀地经漏斗成一细流慢慢装入管内,中间不应间断.时时轻轻打玻璃管,使填装均匀.全部加入后,加入溶剂,使氧化铝全部润湿。
   一般以湿法装柱为宜,因为容易把夹杂在氧化铝中的气泡赶出.无论采用那一种方法装柱,必须注意:
1.不能使氧化铝中有裂缝和气泡,否则影响分离效果。
2.氧化铝的高度一般为玻璃管高度的3/4.
3.装好的氧化铝柱上面覆盖一层滤纸、玻璃丝或棉花,以保持氧化铝上端顶部平整,不受流入溶剂的干扰、如果氧化铝顶部不平,将来易产生不规则的色带。
4.氧化铝柱上面要覆一层溶剂,约0.5-1厘米高,勿使氧化铝露出溶剂
图2.61柱色谱装置的液面,上面装一分液斗。
5.分离1克样品,需用氧化20-50克,依照样品的性质而定。
柱色谱装置
(三)加样:将要分离的样品溶在一定体积的溶剂中配成样品溶液将氧化铝上的多余溶剂放出,直到柱内液体表面到达氧化铝的表面时,停止放出溶剂,沿管壁加入样品溶液,注意不让溶剂把氧化铝冲松浮起.样品溶液加毕后,开放活塞,使液体渐渐放出,至溶剂液面和氧化铝表面相齐(勿使氧化铝表面干燥),即准备用溶剂洗脱。溶
解样品的溶剂要选择适合:
1.溶剂要求较纯如氯仿中含有乙醇、溶剂中的水分及不挥发物质等杂质,常会影响样品的吸附和洗脱。
2.溶剂和氧化铝不能起化学反应,如起了反应氧化铝的组成受到破坏,即要失去吸附能力。
3.溶剂的极性应比样品小一些,如果大了样品不易被氧化铝吸附。
4.溶剂对样品的溶解度不能太大.如溶解度太大,易影响吸附.也不能太小,如太小,溶液体积增加,易使色谱分散。
5.常用的溶剂有石油醚、苯、乙醇、氯仿、乙等,沸点不宜过高,一般在4080C之间.有时也可用混合溶剂、如有的成分含有较多极性基团,在极性小的溶剂中的溶解度太小时,也可先选用极性较大的氯仿溶解,而后加入一定量的苯,这样既降低了溶液的极性,又减少了溶液的体积。
(四)洗脱及分离:样品吸附在氧化铝柱上后,用合适的溶剂进行洗脱,这种溶剂称为洗脱剂,如果原用的溶解样品的溶剂冲洗柱后,不能达到分离的目的,可改用其他溶剂、一般极性较大的溶剂容易破坏样品和氧化铝之间的吸附现象.溶剂极性大,易将样品洗脱下来,但又不易达到样品中多组分分离的目的.因此常用一系列极性渐次增大的溶剂如石油、苯、乙醚、氯仿及甲醇等顺次洗脱,为了逐步提高溶剂的洗脱能力,也可用混合溶剂作为过渡顺次用石油、石油一苯、苯、苯乙醚、乙醚、乙醚一氯仿、氯仿一甲醇、甲醇等洗脱.品中各组分在氧化铝上经过吸附,溶解,再吸附,再溶解规律地自上而下移动而互相分离.如果样品各组分有颜色,在氧化铝柱上的分离情况就能直接观察出来.可以用洗剂洗脱后,分别收集各个成分.在多数情况下,化合物没有色,那就要继续洗脱,分段收集洗出的溶液利用下节所述的薄层色谱和纸色谱检定每部分的成分.合并相同的部分,蒸去溶剂,即可得单一化合物。
在洗脱和分离的过程中,应注意下列几点
1.要继续不断地加入洗脱剂,并应保持一定高度的液面.在整个操作中应注意不使氧化铝表面的溶液流干.一柱面溶液流干后,再加溶剂,易使氧化铝柱中发生气泡和裂缝,影响分离.
2.在收集洗脱剂时,多采用等份收集.每份洗脱剂的体积随所用氧化铝的量及样品分离的具体情况而定.一般情,若用50克氧化铝,每份洗脱剂的体积常为50毫升.如洗脱剂极性较大或样品各组分的结构相近似时,每份的收集量要小。
3.应控制洗脱剂流出的速度,流速不应太快若流速太快,柱中交换来不及达到平衡,因而影响分离效果。
4.由于氧化铝表面活性较大,有时会促使某些成分破坏,所以应尽量在短时间内完成一个柱色谱的分离,以免样品在柱上停留时间过长,发生变化。
(五)氧化铝的再生:将氧化铝上端深色物质除去,用甲醇、稀醋酸、氢氧化钠溶液及水洗涤,再经过高温活化.检查合格后,可以重复使用。
再生氧化铝的检查方法:取回收的氧化铝约10克装柱依次用50毫升石油醚、苯、乙醚、氯仿、甲醇等洗脱,分别干,如无残渣,即可继续使用。
  对再生氧化铝的活化,可适当延长高温加热时间,以促使氧化表面的有机物分解.一般来说,氧化铝可重复使用多次.其次数依色谱过程中有机物污染的程度而定除了上述以氧化铝为吸附剂的柱色谱外,也有用硅胶为
吸附剂、或用纤维素为载体的柱色谱.硅胶用于酸性及中性化合物的分离;纤维素主要用于分离极性较大的化合物,效果较好。
  硅胶以通过100-160目或160目以上筛孔为宜,应用硅胶的柱色谱的操作方法和上述相同纤维素可从脱脂棉制取.取脱脂棉50克,剪成小块,加入5%盐酸600毫升,加热煮沸3小时.放冷后,抽滤,用蒸馏水洗至中性,并且没有氯离子为止.再用95%乙醇洗涤,使滤液没有黄色为止干燥,磨细,通过80-120目筛孔,在105℃干燥2小时后备用.由于以纤维素为支持剂的柱色谱是属于分配色谱分离,所以要先用固定相饱和,再用移动相处理,达到平衡后,再加入样品溶液,进行分离。
薄膜塑料柱色谱
  最近十年来,在一般柱色谱的基上,吸取薄层色谱的优点,发展了薄膜塑料柱色谱.它的实验方法是将吸附剂填装在膜塑料(尼龙或聚乙烯)制的柱中,将要分离的混合物附着在柱的顶端,加展开剂,利用毛细管作用及重力作用,使溶剂慢慢向下移动,而将混合物展开.当溶剂达到柱的底部时,一般即完成了分离,用小刀沿着分离部位将柱子切开,从分段的吸附剂中,用溶剂提取所要的化合物。
此法的优点是:(1)分离时间短,一般当溶剂到达柱的底都时,分离即完成(2)分离效果好,从薄层色谱上摸索到的条件,可以直接应用到薄膜塑料柱色谱上.(3)分离数量大,一根3.8×50厘米氧化铝柱可以分离多至7-8克样品,可以满足实验室一般研究需要(4)溶剂消耗少,不需用大量洗脱。
  其缺点是对薄膜塑料有腐性的溶剂不能应用薄膜塑料柱色谱的实验方法和一般柱色谱基本相同兹将其实验要点简介于后.
1.柱子的准备:一般可用薄膜塑料制成,这些薄膜必须具备下列条件:()坚固而容易切开,(2)不受一般溶剂腐(3)能透过紫外光线及(4)经济价廉.尼龙及聚乙烯薄膜塑料能符合这些条件.这些塑料可以制成不同直径的圆柱,按要可割成不同长度,其厚度以能耐压和易切开为度,一般以0.05毫米为宜.分离一般化合物2克,可选用2.5×3厘米的柱子,对于难分离的混合物,可加大柱子的直径和长度。
2.吸附剂:常用氧化铝及硅胶为吸附剂.应用硅胶为吸附剂,柱子要加长一倍,因为硅胶的密度较氧化铝大一倍.宜用活性较低的吸附剂,II-III较好.颗粒规格应较细,一般以200-300目较好氧化铝的用量和待分离样品的数量和难度有关分离一般混合物,每克样品约需用氧化铝70克对于难分离的混合物,每克样品所需的氧化铝可达300克。
8.装柱:将适当长度的柱子的一端封闭(也可用绳子扎紧),装填一层玻璃棉,在柱子的底部(玻璃棉的下面)扎一些小孔。将吸附剂通过漏斗倒入柱内,装至柱的1/8高度时,将柱子在硬的表面上敗击几次,使柱内吸附剂装紧(如将样品装入熔点毛细管中一样),再装至1/3高度,同样处理装紧最后装至预定高度,装好的柱子应很结实,能用夹子夹住。
  由于薄膜塑料圆柱常以扁平型成卷保存,二侧常有深的折痕,影响装柱,一般可照下法装柱;即将柱子一端封住或扎紧后,装入一层玻璃棉,而后将柱子上端插入一段玻管,玻璃管有一浅沟,便于将薄膜塑料柱子扎住,通过橡皮塞将柱子放在一个大的玻璃套管中,经过玻璃套管的底部,轻轻抽气,薄膜塑料柱子即展开.用一粗颈漏斗,加入吸附剂,边加入边用一平头玻棒捶击装紧后,在柱子下端扎一些小孔,即可应用(图2.6.2)。
图2.6.2
4.上柱及展开:将样品溶在少量低沸点的溶剂中,加入约5倍量的吸附剂,拌合后烘干,均匀地加在柱的上端,上面再覆盖少量吸附剂和一层玻璃棉.加入展开剂,柱的顶端可保持有3-5厘米厚的液面,可用一个用橡皮塞塞住的分液漏斗控制。
  所用的展开剂,可先在薄层色谱中用同样目数的吸附剂摸索条件.所得的结果可以直接应用到柱子上去,也可先用一根1×20毫米的毛细管,上端有喇叭口,便于加料,下端用棉花塞住,用同样的吸附剂摸索展开条件。
  如能控制所需展开剂的用量,则分离时可不需看管,任其自动停止.一根2.5×50厘米的柱子,约需溶剂90毫升,50×50厘米的柱子约需600毫升.如果混合物很难分离,则可继续滴加展开剂,使混合物继续展开,这相当于延长柱子的长度,应尽量利用柱上的地位(九料化工https://www.999gou.cn/)。
5.检査和分离:有色混合物的分离,可按色带用小刀将柱子切开,将各段吸附剂分别放在沙氏提取器中用溶剂提取,对于无色混合物,有的可在暗室中,经紫外线照射,发出萤光,据此定位分割,有的无色混合物不能产生萤光,则可在吸附剂中加入0.5%无机萤光粉,混合均匀后使用,根据萤光的消失来定位.最简单的方法,可参考薄层色谱上的比移值(R∫)将柱子分割几段而后用溶剂分别提取,用薄层色谱法鉴别合并相同部分,选取需要的化合物。

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