液相色谱分辨率
抖化学 / 2022-09-17
高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。HPLC分离基于溶质在流动相和固定相之间的分配，涉及的参数较多，例如，溶质的物理化学性质和分子量；流动相的性质、组成、温度、pH值和流速；以及固定相的化学性质和尺寸会影响分离质量（保留时间、选择性、效率、压降、峰面积）。弄清个中关系还是比较困难的。我将用最简单简洁的语言，讲明白其中的逻辑。
分辨率
两个相邻谱带之间的分离度称为分辨率Rs,其定义为两谱带中心之间的距离除以同一单位表示的谱带平均宽度，即
VR2 -VR1
Rs=2(-------------------)(以体积表示)
ω1+ω2
或
tR2-TR1
Rs=2(-------------------)(以时间单位表示)
ω1+ω2
从峰的转折点所引切线与基线相交求得ω(见图1-1 )。因为对于两个刚好分开的谱带，ω1≈ω2和σ1≈σ2, 方程( 1-23a )简化为
⊿VR
Rs≈--------------
ω
又因为对于一个给定的谱带，ω2 等于4倍标准偏差(σ2)，方程 1-23b )简化为
tR2-tR1
Rs≈----------------
4σ2
当Rs=1.5时，相邻谱带接近于完全分离，重叠少于1% (6σ分离)。
当Rs=1时谱带之间的重叠等于4σ,但两个峰的存在已易于辨认。然而当Rs进一步减小时，则两个谱的存在就变得较难识别，尤其当两个谱带大小不等时更难区分。这种影响用图解表示于图1-5。
图1-5不同分辨率Rs和峰的大小不同时得到的分离度和峰形
分辨率的方程式
Rurneu指出,将用谱带宽度和谱带中心距离表示分辨率的简单方程转换为采用更基本的参数表示，就能得到关于支配分辨率的各种因素的更多的信息。
分辨率方程式(1-23)可用方程(1-20)转换成
在此可引入分离因子(选择性因子)a
k’2 k’2
a=---------=---------
k1 k1
即a是容量因子比，或更切实地说是分配系数比。将负引进方程(1-25)可得
这样就可看到分辨率是三个因子的函数:柱效率N,分离因子a和容量因子k’。方程( 1-27 )在色谱中是一一个极重要的关系式，因为它把三个重要的参数和它们对分辨率的影响联系起来。而且应该记住，作为初步近似，这三个参数可以独立地变化，因此考虑这三个变数对分辨率的影响是有启发性的。
N只是一个纯数字，但它与柱的动力学有关(见第2章)，可由改变色谱床的长度，变化颗粒的大小，增减流动相的速度而变化。于是，可以增大N的任何柱子结构的改善，也能增大Rs;但要记住，这是平方根的关系，即假如N从100增加至625理论塔板，分辨率仅增加到2.5倍，而不是6.25倍。a和k'是溶质一-溶剂一溶剂相互作用的函数，或者说是色谱系统的热力学，而a和k的变化是由改变柱中固定相与流动相之比，选择不同的相体系，以及调节温度等等来完成。
于是，当a≥1时，(a- 1)/a的值从0到1(a很大时),即当a=1时不可能分离，但只要a略大于1就对分辨有很大的作用，当a=2.0时，两个组分的分离应是易于完成的。
k'也能对分离具有深刻的影响，k'在高值时k'/(1+k' )-→1。这可能使人想到k’值应该高，但如果时间对分析来说是重要的话，情况就并非如此了。高的k’值导致非常长的保留时间，同时谱带宽阔而稀释，难以检测。情况表明，如要获得合理的分析时间，k’不应比5大很多。
因此，当利用分辨方程以使给定的分离最佳化时，首先要调整的因子是k'，k'值在1.5和5之间(见下文)是一种合理的折衷，此时分离时间增加不多[5、6 ].其次，选择N以提供与合理的分析时间相协调的最高柱效率，但如分离仍成问题，则可改变流动相的组成以改变a，从而使固定相具有更大的选择性。
液相色谱基本原理是分离度(也叫分辨率)正比于
四分之理论塔板数n的平方根乘以
选择因子a比上a-1再乘以
分离因子k+1比上k
我认为分离度和这些变量是正比关系而不是准确的等于，如果非要说是等于的关系，再加上一个常数可能会更合理。
n和柱长(正比)、粒径(反比)、固定项填料(全多孔硅胶型，表面多孔/核壳型)有关
a和流动相种类(反向色谱：甲醇和乙腈)、pH(2到9)、柱温有关
分离因子/保留因子(平衡状态下，固定相中含量与流动相中的比值)和流动相种类、流动相比例、柱温、固定相填料有关.
在遇见液相色谱仪哪些异常情况？又是如何解决的？
主要是：峰的问题：峰前沿，峰重叠，峰拖尾，鬼峰，基线漂移。压力问题：超压，低压，压力波动。硬件问题：日常损耗，零件损坏。
液相色谱的主要部件有哪些？
液相色谱的部件，我以我使用过的安捷伦为例吧！按流动相流路的顺序：流动相→真空脱气机(在线脱气装置)→泵(二元泵和四元泵：区分，有几种流动相按一定比例混合)→进样器(手动和自动)→柱温箱→检测器(紫外：朗伯-比尔定律，质谱：荷质比，荧光：跃迁，elsd：蒸发光)
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