甲烷单加氧酶中组分D-orfY的发现与功能和定点突变实验及分子生物学研究
化学先生 / 2019-07-29
1：甲烷单加氧酶中组分D-orfY的发现
在第一个甲烷单加氧酶的基因序列测定中，就发现在整个基因序列申有一个小的开放阅读框，编码为orfY,但迄今尚未从甲烷氧化细菌中分离出该蛋白，对它的功能也不清楚。该基因位于mmoZ与mmoC之间，分子量约12kDa，称为MMOD,如图2-2所示。Merkx 对这个位于mmoZ与mmoC之间，功能未知的片断orfY,在E.coli 中进行了克隆表达，获得了纯的MMOD蛋白，通过WestenBolt分析，在Bath中确有MMOD存在。一个可能的解释是该蛋白组装在MMO双铁核中心内，其功能是通过MMOD与MMOH结合，对MMO的活性进行调节，如对丙烯环氧化反应有一定的抑制作用，即MMOD有抑制MMO活性的功能。将二倍的MMOD添加到MMOH中，可使MMOH的UV光谱发生明显变化，证明了该蛋白有可能组装在MMOH双核铁中心内。
2：甲烷单加氧酶的定点突变实验
2002年，Callaghan[57]等发表了 针对组分B的不稳定性原位突变试验结果。他们发现，由于组分B的N端12个氨基酸水解，造成了MMO的失活，其中最敏感的氨基酸残基是Ser4-Tyr7.当这些氨基酸残基被突变后，水解速度明显降低，组分B的稳定性提高;当这些氨基酸残基被去除后，发现对MMO的活性产生很大影响;说明这些氨基酸残基对MMO的活性和组分B的稳定性是必需的。使这些必需的氨基酸发生水解的原因，可能是组分B内在的亲质子活性，而在培养基中添加Cu2+之后，可使sMMO失活，但并未抑制组分B的水解。Brandstetter 对Bath菌的MMOB进行突变发现，在组分B的N端，Serl-Ala25 是不稳定的，易发生水解，因此他们将Gly10突变为Ala, Gly13突变为GIn, Gly16 突变为Ala,结果水解被抑制。在这一工作中，他们使用pkk223-3质粒和E.coliJM105宿主，pET-15b 质粒和E. coli BL21宿主进行突变体的表达。
3：颗粒性甲烷单加氧酶的分子生物学研究
对Bath菌的pMMO基因序列也有人进行了基因测序和克隆表达，发现三个亚基是pMOC、pMOA和pMOB,其基因序列与固氮菌中的氨单加氧酶基因序列非常相似，这说明它们在进化中是密切相关的。Mtrichos porium OB3b和Methylocystis sp. M的全部pMMO基因序列已被克隆，它们由2个相同的单体组成，与氨单加氧酶序列的相似性相当高，有42% ~ 87%的基因序列同一性和58%~95%的氨基酸序列同一性。1999年Stolyar将构建的Bath菌染色体插人突变菌株，发现pMOC和pMOA亚基是高度疏水性的，pMOB有2个跨膜区，表现出对E. coli宿主的毒性作用。因此，pMMO在异型宿主中表达可能比较困难，但它的基因序列信息可作为基因探针，用来检测自然界中甲烷氧化菌的存在与多样性。
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