梯度洗脱
抖化学 / 2022-10-22
梯度洗脱LSC中经常遇到的是多组分样品，其中同时包含有弱吸附物质(低的K'值)和强吸附物质(高的K'值)。没有一个等强度的混合物能够在合理的时间内，或以可测定的浓度洗脱全部组分，而又同时具有良好的分辨率。这种共同的情况称为“洗脱色谱的普遍问题(GEP)”[13]。为了适当地处理这类样品，必须在色谱展开期间改变谱带的迁移速度。程序变溶剂(梯度洗脱)是解决GEP最常用的技术。
程序变溶剂涉及到在色谱展开期间流动相强度的变化(即dδ°/dt )。通常是在分离过程中增加δ°值。变化可以分阶或连续地进行。在HP-LC中不常采用阶式变化，因为δ°值变化太剧烈时，可能发生溶质顶替作用。实际上，强得多的溶剂前沿经过柱子时把溶质“携带”在一起(即在此新的溶剂中K'≈0 ),它们流出时是未分开的或分辨很差的谱带。如果其变化(δ°2~δ°1)较小，则溶质顶替的可能性就减少。Scott 和Kucera[19]提出，为了包括0≤δ°≤0.85这一范围，至少需要12种纯溶剂。
实验上更方便的是调节一个或多个二元混合物的组成，而不是使用纯溶剂来产生变溶剂程序。大多数现代液相色谱仪都设计成便于使用两种溶剂梯度。如前所述，选择两种δ°值各不相同的溶剂并将其混合，就可以得到处于二者之间的任何δ°值。根据图5-6可知,两种溶剂的8°值相距越远，溶剂的强度-组成曲线的初始部分就越陡峭。Snyderi24) 曾发现de9/dt的线性变化对于LSC是有利的，这是因为: (1)诸峰间隔相等，得到单位时间内的最大分离度; (2)近似于相等的谱带宽度，可利用检测器的最大灵敏度; (3)没有由于压缩了峰形拖尾而出现谱带分裂，(4)对已经测量或估算了K'值的溶质则可计算其保留体积。当在程序变溶剂中使用二元溶剂混合物时，可利用凹形梯度轮廓来实现dδ°/dt的线性变化。图5-8描述了甾体类在薄壳硅胶柱上进行的程序变溶剂的分离。
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