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高速液相色谱


化学试剂,九料化工商城 / 2020-11-30

   (一)高速液相色谱的意义:气相色谱法具有分辨能力强,分析速度快,灵敏度高等优点,已如上述,但其缺点是只能对在操作温度下能气化而不分解的样品才能分离分析.诉多有机化合物不易挥发,遇热易分解,即不适用据文献报导,在目前已知化合物中,仅20%可用气相色谱法进行分离分析,因此拟改用以液体为移动相的液相色谱以克服这个缺点但分离分析所需的时间是取决于样品在移动相和固定相之间的分布和达到扩散平衡所需的时间,由液体移动相运转样品所需的时间显然要长得多,这样就必然要延长分离分析的时间。随着高压泵的采用和色谱柱填充剂的改进,加速了液体移动相的流速,可以大大缩短分离分析时间,这就产生了高速液相色谱(亦称高压液相色谱).由于高速液相色谱可以选用更多种的液体移动相和固定相以及采用高灵敏度的检测器,使高速液相色谱的分辨和分离能力不断提高,应用范围日益扩大,因此又称高效液相色谱。 

  目前常用的高速液相色谱可分为分配色谱,吸附色谱,离子交换色谱及排阻色谱等等。

  (二)仪器及其主要部件:高速液相色谱主要由溶剂槽、梯度装置、泵、色谱柱、检测器、记录仪及分部收集器等部件组成其操作流程和气相色谱基本相同(图2.7.4.所不同的只是用高压泵输送液体代替了气体。
  1.梯度洗脱:在气相色谱里,广泛地采用程序升温控制以改进宽沸程样品的分离和缩短分析周期.在高速液相色谱中,则常采用梯度洗脱.所谓梯度洗脱即是在色谱分析过程中,不断地改变移动相的化学组分.采用梯度洗脱可以提高分辨能力,缩短分离时间,改善峰形,提高灵敏度。
高速液相色谱
  2.泵:在气相色谱中,一般是利用高压气瓶提供具有定压力、流速的气体;而在高速液相气谱中,则需用泵来完成这一任务.所以泵是高速液相色谱中一个重要部分.它须具备下列条件:(1)对于一般分离,压力在70公斤/厘米左右,对于高效和高速分离,压力在350公斤/厘米左右;(2)无脉冲,流量恒定,只有2-3%误差;(3)有较高的送液流量,可变范围0-10毫升/分;(4)耐高压,耐腐蚀,适用于梯度洗脱。
  3.色谱柱:色谱柱是高速液相色谱中的心脏部分,分析用的色谱柱常用内径1-3毫米的柱子,制备用的则可采用25毫米或更粗的柱子.柱长从几十厘米到几米,甚至可以更长柱子加长可以改善分离效果,但要提高柱子的压力,且分离时间也要加长,柱子用不锈钢制成.压力较低时也可用厚壁玻璃管制成,依柱子的长短,可制成直形或U形。
   高效填充剂的研究成功,促使髙速液相色谱得到飞跃发展对于填充剂的要求是球形,颗粒范围狭,机械性能好,在高下不会破碎等.一般可分为多孔层珠和全孔性微粒两种。多孔层珠是在固体核心如玻璃珠表面包覆一层或几层很薄的有空隙结构的多孔性材料如硅胶,氧化铝,聚酰胺或离子交换树脂等等,也可将多孔外层与有机化合物进行化学反应成为永久键合的固定相.全孔性微粒为直径极小(5-15微米)的微粒,多孔层珠的优点是分离能力高但表面积小,样品容量少;全孔性微粒的优点是表面积大,样品容量大,可以用于大量样品的分离,但分离能力较差.目前高速液相色谱使用的载体很多,不同类型的高速液相色谱可选用合适的载体。
4.检测器.在色谱分析中,样品组分经色谱柱分离后,通过检测器,将先后流出的每个组分,按其物理的或化学的特性来转换为易测量的电讯号,才能确切了解它的组分.所以检测器是检定和测量样品中不同组分及其含量的一个敏感器也是高速液相色谱中的关键部位.目前广泛应用的有紫外光度计(UV)及示差折光计(RI),其次是微吸热检测器(MAD)及火焰电离检测器(FID)等,对于检测器的基本要求是稳定性好,灵敏度高,响应快,对柱效率无损失,线性范围宽和应用范围广等等.
  (三)基本原理及其在有机合成中的应用:高速液相色谱的基本原理根据不同类型而有所区别:
   分配色谱:即液色谱.它的固定相是以液体涂渍在一个惰性载体上构成的.移动相是一种和固定相液体不相混合的液体,样品分配于二种液相之间进行分离其基本原理和纸色谱相似.适合于不稳定或易起分解、水解和异构化等物质的分离。
   吸附色谱:以吸附剂如硅胶氧化铝、聚酰胺等为固定相液体移动相中的溶剂和样品组分在固定相上吸附和解吸交替作用而达到分离的目的基本原理和吸附薄层色谱相似.适合于替代基团差别很小的混合物如芳香氯化物和若香溴化物以及各种立体异构体的分离。
   离子交换色谱:以离子交换树脂为固定相,由于移动相样品组分和离子交换树脂有不同亲合力而得到分离适用于氨基酸、核酸以及各种无机金属化合物的分离。
   排阻色谱:即凝胶色谱.以一种新型的分子筛为固定相,利用样品组分的分子大小渗透到一定孔径的固定相中的不同速度而得到分离。
   高速液相色谱和气相色谱一样,可以对未知样品进行分离,定性、定量分析以及制备纯品.应用样品的相对保留值可以测定样品的纯度和鉴别样品的组分.应用已知样品作对照或利用二种检测器求其样品组分的响应比,可以提高鉴别能力从所得图谱的峰高或面积之比,可以测求样品组分的含量,也可用积分仪定量.应用分部收集器可以制备样品组分的纯品。
胆甾醇苯乙酸酯粗品的色谱图苯二胺异构体色谱图
   高速液相色谱已广泛应用于化学合成,化学分析及医药研究等方面。
   如在合成胆甾醇苯乙酸酯( cholesteryl phenylacetate中常混有少量杂质,应用一般方法,极难纯化.应用高速液相色谱,在内径23毫米,长度为2×0.5米的色谱柱中,用sphe rosil XOA400为填充剂,以己烷-二氯甲烷(0.1%甲醇)为移动相进行梯度洗脱,柱入口压为70公斤/厘米2,流速为30毫升/分,紫外光度计为检测器,室温,样品溶剂为二氯甲烷等条件下进行分离制备,从1克样品可得近1克的纯品,损失极少(见图2.7.5)(九料化工https://www.999gou.cn/)。
   苯二胺异构体的分离分析,用一般化学方法及气相色谱都不易解决,应用高速液相色谱,在色谱柱内径为2.1毫米,长度为1米,填充剂为多孔层珠( corail III柱入口压力为3公斤/厘米,流速为2毫升/分,室温,以甲醇一环戊烷为移动相,紫外光度计为检测器等条件下,可得到很好的分离效率(图2.7.6)
  苯并二氮杂草类( benzodiazepine)化合物是一类中枢安定药,为了研究它在体内的代谢产物,用一般方法,需用繁复的分离手续,应用气相色谱,则需改变原来结构或用其衍生物进行分离分析,现用高速液相色谱,能较快地把它的代谢产物分离.对于未知代谢产物,可用制备分离,取得纯品.再用其他化学和物理方法测定结构.在色谱柱内径1毫米,长度1米,以 OPN Durapak(一种化学键合硅胶珠)为填充剂,10%异丙醇-烷为移动相以及用紫外光度计检测器等等条件下,可得苯并二氮杂草类一“安定”及其代谢产物的色谱图(图2.7.7)。
“安定”及其代谢产物的色谱图(图2.7.7)
   自从气相色谱建立20年、高速液相色谱建立近10年以来,大大促进了分离技术的水平.目前尚在继续发展.如气相色谱已从过去用一种气体发展到应用混合气体为移动相在高速液相色谱方面,由于新的填充剂的不断发现,更推动了高速液相色谱的发展,使分离分析能力更为提高.制备分离技术的进展更有利于有机合成及植物化学的研究,色谱质谱的联用,色谱一红外光谱的联用,使应用更为广泛.本节仅介绍一些有关气相色谱及高速液相色谱的概况深入的了解可参阅下列书籍。
1.气相色谱法:中国科学院大连化学物理研究所,1972年,科学出版社。
2.填充气相色谱:中国科学院甘肃化学物理研究所,1973年,燃料化学出版社。
3. Basio Liquid Chromatography, Nina Hadden,等1971年。
4. High Pressure Vig uid Chromatography, Biooheaioal and Biomedioal A pplications: P. R. Brown, 1073年。

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