固定化酶的催化活性
化学先生 / 2019-08-03
在水溶液中游离酶分子与底物同处于液相，外部环境儿乎相同，而酶被固定化以后，则处于载体的各向异性微环境中。由于载体物理化学性质对酶与底物的作用和影响，从而可能引起酶的性质发生变化。和游离酶比较，固定化酶性质的改变，主要是由于酶处于载体的微环境中，会引起活性中心的氨基酸残基、高级结构和电荷状态等发生变化。而载体对固定化酶性质的影响，则主要表现在固定化酶周围，会产生立体和扩散效应，影响反应中酶和底物分子的接触。根据大量的实验观察证明，可归纳为空间效应、分隔效应和扩散效应。
(1)空间效应载体的存在会对酶的活性部位或调节部位起掩蔽作用，造成空间位阻，影响酶的活性中心与底物的接触，从而降低固定化酶的反应活性(图8-2)。对于大分子底物，空间效应的影响比较明显;而小分子底物，由于容易克服载体造成的立体障碍，与酶的活性中心进行反应，空间效应则不明显，对固定化酶活力的影响不大。为了提高酶分子的空间自由度，使固定化酶适应较大分子底物的催化反应，可以加长载体与酶之间桥接的分子链长度，但只有采用有机载体和共价键结合的固定化方法才能做到这一点。 在用包埋法进行酶的固定化时，因为酶被高分子物质的半透膜所包围，也会影响大分子底物与酶之间的相互作用，对于小分子底物的影响则较小，也应属于空间效应。
(2)分隔效应在固定 化酶催化反应过程中，即使酶的分子不发生变形，由于反应体系从均相转变为多相，也会使固定化酶和反应液之间产生各种组分，如氢离子、底物、产物、抑制剂、活化剂和辅酶等浓度梯度的变化。这种变化对固定化酶活性的影响称为分隔效应。分隔效应反映了固定化酶所处的微环境对其反应活性的影响，早在20世纪70年代初就有人对这种现象进行了理论分析。当固定化酶载体表面带有负电荷时，由于静电吸引作用，靠近固定化酶表面的氢离子浓度会比溶液中高。也就是说，固定化酶所处微环境中的pH要低于液相，这样实测的反应最佳pH将向碱性区移动。反之，固定化酶载体表面若带有正电荷，则会对溶液中的氢离子产生排斥作用，使实测反应液的pH偏低。带电固定化酶载体表面与周围溶液之间的pH差值可用下式表示:
△ pH=0.43e/ψκΤ
式中，e为电子电荷; ψ为固定 化酶的表面电势; k为玻尔兹曼常数: T为热力学温度。实验证实，分隔效应引起的固定化酶反应最佳pH的变化，最高可达3个单位。
带电载体固定 化酶与带电底物、抑制剂和其它组分之间的相互作用,也可以同样进行定性和定量的理论解释。固定化酶反应体系中组分浓度分布的不均匀性，除静电作用以外，还表现为亲水性和疏水性等其它形式。加强搅拌可以抑制分隔效应造成的不利影响。
(3)扩散效应光酶的固定化使生物催化反应从均相转化为多相过程，这样就产生了反应底物从液相向固定化酶表面传递时产生的扩散阻力。多相化学催化反应过程中的经典传质理论，同样也适用于固定化酶催化反应过程。扩散阻力也可以分为外扩散和内扩散两种，外扩散是反应底物从溶液向固定化酶表面扩散时，穿过水相和固定化酶之间的边界层产生的，也称为液膜扩散阻力;内扩散是底物分子到达固定化酶表面后，向结合有酶分子的载体内孔扩散产生的阻力(图8-3)。 扩散效应可以通过选择适宜固定化载体的形状、减小粒子尺寸、提高底物浓度、强化搅拌或增加流速等加以改善或消除。
扩散效应在个别情况下也可以给酶催化反应带来好处，例如，在多酶共固定化的反应体系中，当反应为:A→B→C→....→Z时.如果中间产物在载体内部的扩散速率减慢，将有利于提高生成最终产物2的总包反应速事。
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